2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授领导的团队在《Nucleic Acids Research》（影响因子=167）上发表了一篇题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”的研究文章。该文介绍了一种基于CRISPR/Cas12a的新型单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（高能量惩罚SNV检测平台）。该系统采用二元crRNA结构设计，激活Cas12a的切割活性，并通过非平衡杂交驱动放大单核苷酸错配信号。

HEPSD在极端GC含量的情况下，能够高效区分难以检测的SNV，包括摆动突变，其对临床样本的区分准确度与定量PCR（qPCR）及二代测序（NGS）结果高度一致，准确率可达100%。这一平台的有效性证明了其在临床分子诊断中的巨大潜力，且其设计原理也可扩展到其他CRISPR系统。

研究背景

单核苷酸位点变异（SNVs）是一种常见的遗传变异形式，与多种严重疾病（如癌症、单基因遗传病和传染病）的发生紧密相关。传统的SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等）往往无法有效识别某些难以检测的SNV，例如高GC含量区域的变异。CRISPR-Cas系统，特别是Cas12a，在核酸检测领域具有革命性意义，但其在crRNA介导的识别过程中对所有单碱基错配的特异性仍有所欠缺。

研究结果

1. RNA/DNA二元探针与热力学分析

研究中设计的二元探针（BPs）由两个杂交臂构成，包括一个长臂和一个短臂，专门用以通过选择性杂交区分SNVs。研究人员比较了线性探针（LPs）与BPs，发现BPs在更广泛的温度范围内表现出良好的性能。

2. 非平衡杂交驱动的SNV检测系统

基于BPs对Cas12a的激活性能，研究者设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构，并结合Cas12a系统开发了HEPSD平台。分子动力学模拟和荧光各向异性实验表明，HEPSD在匹配目标上形成稳定的三元复合物，而在错配目标上则表现出动态不稳定性，从而有效抑制Cas12a的激活。

3. HEPSD对难检测SNV的高效区分能力

HEPSD的检测性能经过评估，显示该平台能够有效区分传统方法难以检测的SNV，包括高GC含量区域突变和摆动碱基对的错配，其检测限低至0.01%的突变等位基因频率（VAF）。凝胶电泳和实时荧光实验结果显示，HEPSD在完全匹配的目标上保持高效切割活性，而对错配目标几乎无活性。

4. HEPSD分析BRAFV600E和EGFRL858R突变

为进一步评估HEPSD对临床相关癌症突变的有效性，研究者选择BRAFV600E和EGFRL858R作为研究靶点。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本中，HEPSD的敏感性和特异性均达到100%，与qPCR和NGS的结果高度一致。在血浆样本中，HEPSD成功检测到低丰度突变（VAF低至0.01%），优于传统qPCR方法。

结论与展望

本文介绍的二元crRNA辅助的CRISPR/Cas12a平台（HEPSD）通过创新设计和非平衡杂交驱动机制，显著放大了错配碱基的能量惩罚，从而实现了高特异性识别。HEPSD在高GC含量等复杂环境中表现优异，成功地检测和鉴定了BRAFV600E及EGFRL858R变体，准确率达到100%。这表明该平台在临床分子诊断中具有巨大的潜力。总之，HEPSD平台的研发为癌症早期诊断与个性化治疗提供了新工具，同时其设计原理也可为其他CRISPR系统的应用奠定基础，未来或能在基因编辑的脱靶控制中发挥重要作用。为此，尊龙凯时人生就博项目为此研究提供了必要的支持，并期待在生物医疗领域的进一步创新。